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免疫荧光技术的实验方法及其分类

导读: 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大,时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕,作为标记物,加入正常液后激发测定,能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

  一、免疫标记法及其分类

  1.荧光免疫法

  原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮,检测产物发出的荧光,荧光强度与Mb浓度呈正比,可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好,线性范围宽,具有快速、敏感、准确的特点。

  以双抗夹心法为例,首先将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体。除去未结合抗体,然后加受检标本,使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物,接着加入荧光标记的抗体,使之与抗原特异性结合,形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度,即可对蛋白抗原进行定量。

  传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大,时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕,作为标记物,加入正常液后激发测定,能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

  2.放射免疫法

  放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原,竞争性地与抗体结合,形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物,并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法,将抗原—抗体复合物与游离抗原分离,分别测定其放射性强度与标准曲线比较,即可对未标记的待测抗原进行定量。

  RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强,可准确定量到ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦,耗时长,且有放射性污染。近年来,随着单克隆抗体的应用,RIA的灵敏度又有了较大提高,且操作大为简化,并已有商品试剂盒供应,使用方便。

  3.酶联免疫法(ELISA)

  ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立,该法的最低检测限为10μg/L,线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高,特异性强,精密度好,操作简单,适用于多份标本的检测,不需特殊仪器设备等优点,易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

  以双抗法为例。首先包被抗原,然后加入一抗,使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。接着加入酶标二抗,形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物,由酶催化底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。

  4.偶联生物素—亲和素系统的酶免法

  利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性,使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。

  5.时间分辨荧光免疫分析

  时间分辨荧光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay,TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。

  6.解离增强镧系元素荧光免疫分析

  解离增强镧系元素荧光免疫分析(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂,使其一端与铕(Eu)连接,另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接,形成EU标记的抗体/抗原,经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱,因此加入一种增强剂,使Eu3 从复合物上解离下来,自由Eu3 同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团,这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光,信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤,因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

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