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用UPLC-荧光/质谱法分析2-AB标记的多聚糖混合物

导读: 针对糖基化分析中的种种困难,沃特世公司开发了亲水作用色谱法,以及荧光-质谱结合检测的分析方法。

  蛋白质糖基化是生命系统非常重要的翻译后修饰之一,在免疫识别,蛋白分泌,信号转导等生命过程中发挥了重要作用。与蛋白相连的多聚糖是这些功能的重要载体,特别是对于单克隆抗体药物,多聚糖部分对药物的生物活性有着重要的影响。因此,发展分离效率高,检测灵敏度好的糖基化分析方法对单克隆抗体药物分析具有十分重要的意义。

  针对糖基化分析中的种种困难,沃特世公司开发了亲水作用色谱法,以及荧光-质谱结合检测的分析方法。ACQUITY UPLC系统配合荧光检测器(FLR)以及多聚糖分析专用(GST )色谱柱,比HPLC方法有更高的分离度。多聚糖分析专用色谱柱装填了1.7μm的酰胺吸附剂,可在HILIC模式下有效分离荧光标记的多聚糖。UPLC配合荧光检测器®分析多聚糖可以获得很高的分离度和定量准确性,特别是对于位置异构体以及有共流出的小峰分析;而质谱检测为糖链鉴定提供了更多的结构信息。通过与标准糖链保留时间的比较,该流程能实现高通量的多聚糖定性定量,满足药物分析的多种需求。

  一、色谱条件与标记后的多聚糖样品的分离

  可通过HILIC方法,有效分离2-AB标记的多聚糖混合物。对于方法优化,使用更缓的窄梯度,可有效提高保留时间上相临近的多聚糖峰之间的分离度;对于其它的参数,如流速、缓冲液浓度、流动相pH及柱温等,一般也需要进行优化。图1示例使用优化后的HILIC色谱条件后,复杂的2-AB标记的IgG多聚糖混合物得到了很好的分离,包括E1/ E2与F1/ F2。实验所用梯度洗脱时间为45分钟,包括色谱柱清洗和再平衡步骤。一般来说,一个样品的总分析时间在1小时内。因此,与使用3.0-μm填料的HPLC方法相比,使用1.7-μm填料的UPLC色谱方法,不但分离效果更好,而且运行时间更短。实验中使用2.1 x150 mm色谱柱。图1(B)中甘露糖5(峰C)与甘露糖6(峰H)可与邻近多聚糖峰成功分离,解决了共流出的问题。

 

 

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