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新光学显微镜技术揭示活细胞生物过程

导读: 来自美国霍华德休斯医学研究所,Janelia研究园的科学家们,借助其发展的新光学超分辨率成像技术,在前所未有的高分辨率条件下研究了活体细胞内的动态生物过程。

  新技术所拍摄的视频生动地展现了细胞内蛋白质的运动和相互作用。它们帮助生物学家理解细胞是怎样改变它们之间的依存结构,以及重整细胞膜结构使得细胞外的分子可以被吸收到细胞内。来自Janelia研究园的研究员EricBetzig博士,李栋博士后*和他们的同事们基于原有的SIM显微镜原理新发展了两种新的超分辨率成像技术。超分辨率光学显微成像技术能够跨越理论的分辨率极限,在极高的分辨率下展现细胞内的精细结构。但是,到目前为止,超分辨率显微镜技术却依然不能进行有效的活体细胞成像。

  “这些方法设立了超分辨率光学显微镜的成像速度和非侵入特性的新标准,它们使得超分辨率活体细胞成像成为现实。”Betzig博士说道。在传统的SIM显微镜中,物镜下的物体被非均匀的结构光(类似于条纹码)所照明。在实验中,几束不同的结构光用来照明物体,它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔条纹被相机依次采集。然后计算机提取摩尔条纹编码的信息并将其解码生成三维的高分辨率图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨率。

  Betzig博士和其他两位科学家因为发展超分辨率荧光显微镜而被授予2014年诺贝尔化学奖。他说道,SIM显微镜技术之所以没有得到像其它方法那样多的关注,是因为其它技术能够提供比两倍更高的分辨率改进效果。但是,他强调SIM拥有两大其它的超分辨率方法所没有的优势。这些其它方法包括了两种去年获得诺贝尔奖表彰的技术:他和同事HaraldHess博士于2006年开发的光激活定位显微镜(photo activated localization microscopy,PALM),和受激辐射耗尽(stimula ted emission depletion,STED)显微镜。但是,这两种技术都需要过多或过强的光来照明样品,以至于荧光蛋白很快被漂白,细胞样品很快被损害,从而不可能长时间进行成像。然而,SIM在这些方面不一样,“我爱上了SIM,因为它的速度很快,而且它所需的照明光强度远远小于其它方法。”Betzig博士说道。

  Betzig博士在2011年Mats Gustafsson博士去世后不久开始与SIM相关的研究。Gustafsson博士是SIM技术的先驱之一,生前也是Janelia的研究员。Betzig博士那时已经深信SIM有潜力为解析细胞内部的工作机理提供重要的见解,如果SIM的空间分辨率可以被提高,它对于生物研究的可用性将被大大增强。

  在生前,Gustafsson博士和博士生HesperRego发展了一种利用饱和耗尽(saturateddepletion)的非线性SIM技术,但这种技术在改进分辨率的同时需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的优势。Betzig博士想到了一种可以避免这些缺陷的方法。

  饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开关过程中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生图像的过程是,首先把所有的荧光蛋白分子激活到可发光的状态(亮态),然后用一束结构光把大部份的亮态分子反激活到暗态。通过结构光反激活之后,仅有少数处于结构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些光调控过程提供了物体的高空间频率信息,从而让图像更加清晰。这一过程需要重复25或更多次才能产生最终的高分辨率图像。Betzig博士说道,这一原理非常类似于STED或另一种与其相关的叫做RESOLFT的超分辨率技术的原理。

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