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献给初学者:PCR常见问题分析

导读: 变性温度是否准确:PCR 仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。

1没有扩展条带

可能的原因及对应的解决方案如下:

酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

变性温度是否准确:PCR 仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。

反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加 Taq 酶以前,将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。

引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。

引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

DNA 凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。

2PCR 产物量过少

可能的原因和对应的解决方案如下:

退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

PCR 循环数不足。增加反应循环数。

引物量不足。增加体系中引物含量。

延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。

DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净

3扩增产物跑电泳条带弥散

可能的原因和对应的解决方案如下:

酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。

dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。

MgCl? 浓度过高。可适当降低其用量。

模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng,而基因组 DNA 则应<200 ng。

引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。

循环次数过多;增加模板量减少循环次数至 30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的 PCR 循环。

退火温度过低。

电泳体系有问题:

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;

②凝胶没有凝固好;

③琼脂糖质量差。

若为 PCR 试剂盒则可能:

①由于运输储存不当引起试剂盒失效;

②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。

降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

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责任编辑:nick
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