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用UPLC-荧光/质谱法分析2-AB标记的多聚糖混合物

2012-03-14 16:47
小鱼时代
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  实验流程:

  一、2-AB 标记糖链

  使用GlycoPro le试剂盒,Prozyme公司

  使用试剂盒进行2-AB 标记糖链时,除以下步骤,按照该公司的说明操作即可。

  1.使用50μl的标记反应液

  2. 65度反应4-5小时

  3.将样品按步骤4处理除掉过量的标记试剂

  使用Sigma公司试剂

  1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液( 3 0 μ l 冰醋酸,700ulDMSO)

  2.按照20:1(v/w)的比例配制2-AB 溶液 (如需要20mg 2-AB,则用400μl 30% 的醋酸DMSO溶液配制)

  3.以16.7:1(v/w)的比例将2-AB溶液与氰基硼氢化钠混合配制标记反应液

  4.将所得糖链用50μl标记反应液溶解,65度震荡反映4-5小时

  5 。将反应液按步骤4处理除去过量的标记试剂

  二、使用MassPrep亲水作用样品处理板除去过量的标记试剂

  所需溶液: MiniQ 纯水,90% 乙腈 ACN,10 mM 醋酸铵Tris,20% ACN

  1.样品处理板活化,向样品处理板加入200μl MiniQ纯水,再加入 200μl 90% ACN,重复 90% ACN

  2.吸取 50μl 标记溶液,加入 450μl ACN( 如有沉淀,请勿离心,以免降低糖链回收率),由于板上每孔体积为200μl,可以将样品分为四份加入

  3.将样品加入处理板,设定真空度为低(压力 250-500 mmHg),以保证样品与HILIC基质有充分时间相互作用;如果溶液在板上没有移动,可适当增加真空度

  4.用 90% ACN清洗处理板两次

  5.换用样品收集板,用200μl 10 mM 醋酸铵Tris, 20%ACN洗脱,洗脱液转移至1ml 离心管

  6.冷冻干燥标记后糖链溶液冻干后的样品复溶于20μl50% ACN中,超声5 min 后转入UPLC采样瓶,进样5μl。

  参考文献

  (1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column

  (2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine

  (3) Joomi Ahn,Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC亲水相互作用色谱(HILIC)-荧光检测法分析2-AB标记的多聚糖

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