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一种简单快速的miRNA检测新方法

导读: 这种方法是将提取纯化的小RNA与5’端生物素标记的DNA探针进行液相杂交,接着用核酸外切酶消化多余的探针,再将杂交液点于尼龙膜上,之后ABC孵育,最后BCIP/NBP、DAB或者ECL显色。

  背景:MicroRNAs(miRNAs)是近年来发现的在进化上高度保守的一类非编码小RNA(~22nt)。它作为转录后关键的基因表达调控子可参与几乎所有的生理和病理过程,革新了我们对基因表达调控的传统认识。miRNAs的检测是其功能研究的基础,但小片段的特性使其检测十分困难。

  PCR和Northernblot是目前检测单个miRNA最广泛使用的两种方法。PCR方法敏感性高,但假阳性的忧虑和引物设计的困难限制了它的使用。Northernblot是非常有效的检测工具,但传统的固相杂交技术程序复杂、时间漫长且操作不便。新出现的液相杂交技术检测速度快,但需要特定的荧光信号检测仪器

  方法改进:我们这里报道一种新的miRNA检测方法:液相杂交显色法(LHCD)。

  这种方法是将提取纯化的小RNA与5’端生物素标记的DNA探针进行液相杂交,接着用核酸外切酶消化多余的探针,再将杂交液点于尼龙膜上,之后ABC孵育,最后BCIP/NBP、DAB或者ECL显色。

  LHCD能够区别miRNA家族成员间一个碱基的差异,其灵敏度可以达到2.5fmol,全过程耗时不到3个小时。本方法由于整合了快速液相杂交和亲和素-生物素信号放大系统(ABC)两大技术,不但实现了miRNA的简单、快速、高灵敏度检测,其可视化的信号目测,还省去了昂贵的信号检测仪。此外,本方法简单的操作流程,使其容易学习和方便使用。

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