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如何使用电穿孔技术对酿造酵母进行基因工程?

欢迎大家订阅电转染小课堂,本期我们将详细介绍如何使用电穿孔技术对酿造酵母进行基因工程。本文中我们将使用ECM 630或Gemini X2(指数衰减波)电穿孔仪为酿酒酵母提供理想的电穿孔参数。

随着人们越来越重视身体健康,以及有关酒后驾驶的更严格法律规定。消费者对低酒精或无酒精啤酒的追求不断增加,这也激励了各啤酒厂扩大对低酒精啤酒的生产。目前生产低酒精啤酒的方法,包含控制发酵或发酵后去除乙醇,但是会导致味道变差或香气成分损失。此外,通过蒸馏或透析来去除乙醇是昂贵且费力的。因此,通过向啤酒厂提供一种转基因酵母菌株,使其在麦芽汁糖的完全发酵过程中产生较少的乙醇,可以建立一种生产乙醇含量较低的啤酒的替代技术。

研究人员Elke Nevoigt等[1]使用电穿孔技术对工业啤酒酿造酵母进行了基因改造,以实现降低啤酒中酒精含量的目标。先前的研究表明,GPD1基因(编码甘油-3-磷酸脱氢酶)的过表达可以改变实验室酵母菌菌株的发酵,使其产生更少的乙醇和更多的甘油。因此,为了验证这种方法是否可以用于降低乙醇含量的啤酒的发酵,该团队创建了一个质粒表达构建体,可以在工业啤酒酿造酵母中过度表达GPD1基因。然后,研究人员用GPD1表达构建体对酿酒酵母进行了电穿孔,并在与工业上生产啤酒的相同条件下进行发酵实验,发酵麦芽汁。发酵之后,该小组测量了发酵的产物,如乙醇和甘油,以及其他影响啤酒口感的发酵产物,如乙醛、丙酮和双乙酰。通过这种方法,研究人员成功地将啤酒中的乙醇含量降低了18%,甘油的产量提高了5.6倍。


以下是使用BTX ECM 630或Gemini X2电穿孔仪对酿酒酵母进行理想转化的方法的总结。使用此方案可实现每微克质粒载体DNA高达1 x10 8转化体的转化效率。

1. 在YPD培养基中将酿酒酵母培养到对数生长期;

2. 离心并洗涤沉淀的细胞数次以除去细胞培养基,并将细胞悬浮在电穿孔缓冲液中,密度为1.6 x 10 9cell/ml;

3. 在以下条件下在2  mm电极杯或2 mm间隙高通量电穿孔板中进行电穿孔细胞:

· 温度:4°C

· 电压:2500 V

· 电容:25 uF

· 电阻:100至200 Ω

· 脉冲数:1

· 所需电场强度:12.5 kV/cm

· 所需时间常数:3至4.5 ms

4. 将细胞置于回收培养基(1M山梨糖醇与YPD培养基的比例为1:1)中,于30°C孵育1 h;

5. 继续进行所需的选择方法,按照要求的选择方法进行。

Reference:

[1]. Nevoigt, E., et al. Engineering of brewing yeast to reduce the content of ethanol in beer. FEMS Yeast Research 2002; 2: 225–232.

自从1938年BTX推出第一台商用电穿孔仪以来,BTX一直处于电穿孔技术的最前沿,一直致力于为各种细胞和组织类型提供完整的转染解决方案,包括真核生物,原核生物,体内组织,卵内,子宫内,贴壁和悬浮培养,植物细胞,皮肤和肌肉免疫。除电穿孔仪外,BTX还为各种应用提供和研发专业的电极。北京德泉兴业商贸有限公司为BTX在北京地区的一级代理。欢迎致电联系我们。

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