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如何实现外源DNA对Chlamydomonas reinhardtii的电转化?

欢迎大家订阅电转染小课堂,本期我们首先将介绍Chlamydomonas reinhardtii(莱茵衣藻)模型系统,之后使用ECM 830和ECM630仪器推荐的方案来实现外源DNA对Chlamydomonas reinhardtii的电转化。最后将传统玻璃珠转化和电穿孔法进行比较。

Chlamydomonas reinhardtii是研究基本生物学结构和过程的优选模型系统

Chlamydomonas具有两条鞭毛,其结构和功能与其他生物的纤毛相似。这些鞭毛可以分离出来用于生化和分子分析,并且已经作为模型系统用于研究纤毛的生物发生和鞭毛内运输(IFT)。

Chlamydomonas可用于研究光合作用。它可以在简单的盐介质上生长,利用光合作用获得能量,或者在完全黑暗的环境中生长,乙酸盐作为其替代碳源。

C. reinhardtii以单倍体营养状态存在,或在不利的环境条件下,两种交配类型可能融合并形成二倍体合子孢子。当条件改善时,二倍体合子发生减数分裂并释放四个单倍体细胞,从而恢复营养生命周期。

C. reinhardtii的核,叶绿体和线粒体基因组的完整序列已被测序和定位。

这些特征可用于正向和反向遗传筛选技术。

衣藻资源中心提供了野生型和突变型培养物及试剂的储存库。

电穿孔是引入外源DNA而无需去除衣藻细胞壁的有效和方便的方法。

高效方波电穿孔方案

在液体TAP培养基中培养细胞,使其细胞密度达到1至2 x 10 7cells/ ml。

将细胞原液接种到新鲜的液体TAP培养基中,使其浓度为1 x 10 6cells/ ml,并在连续光照下生长18至20 h,直到细胞密度达到4 x 10 6cells/ ml。

在室温下,将细胞以1250 g离心5 min,洗涤,之后用含有60 mM山梨糖醇的预冷TAP培养基重悬,然后将混合物置于冰上10 min。

将250 ul细胞悬液(或5 x 10 7cells)放入预先冷却的4 mm电极杯中,并加入100 ng所需的外源DNA。

使用方波发生器(例如ECM 830或Gemini X2)进行电穿孔,使用以下电穿孔参数:500 V,4 ms脉冲持续时间,6至7个脉冲,100 ms脉冲间隔时间。

电穿孔后,将电极杯立即放在冰上放置10 min,然后将细胞悬浮液转移到装有10 ml TAP培养基的50 ml锥形离心管中,在昏暗的光线下缓慢摇动过夜。

根据需要,用适当的选择培养基平板细胞。

预期的转化效率是 每ug外源DNA 2-6 x 10 3转化子。

详情请参见Wang L等[1]方法。

指数衰减波电穿孔方案

如方波电穿孔方案所述,准备电穿孔前的细胞。

使用具有指数衰减波形的发生器(例如ECM 630或Gemini X2)进行电穿孔,使用以下电穿孔参数:800 V,1575Ω,50 ?F。

所需脉冲长度为10至14 ms;高于或低于此脉冲长度范围可能会降低转化效率。

当与上述高效方波电穿孔并行测试时,指数衰减波方法产生的效率约为方波效率的50%。

详情请参见Wang L等 [2] 方法。

与其他衣藻转化方法的比较

玻璃珠转化[3,4]法是利用玻璃珠的搅拌来引入外源DNA。该方法不需要专用设备,但是在玻璃珠搅拌之前,需要特殊操作去除细胞壁。与上述高效方波电穿孔方法比较时,玻璃珠法约为方波法效率的20%。

另一种类型的电穿孔器(衰减方波脉冲发生器NEPA21)进行电穿孔的好处是不需要去除细胞壁。据报道,使用这种类型的电穿孔器进行转化可产生每ug DNA  0.4-3 x 10 3转化子[5]。但是该方法需要相对大量的外源DNA(每个反应400 ?g)。

相比之下,使用ECM 830和ECM 630等发生器进行高效方波电穿孔和优化的指数衰减波电穿孔,每ug外源DNA可获得高达6 x 10 3转化子的转化效率,不需要去除细胞壁,并且每个转化反应只需要100 ?g外源DNA。

Reference:

[1]. Wang, L., et al. (2019) Rapid and high efficiency transformation of Chlamydomonas reinhardtii by square-wave electroporation. Biosci Rep 39 (1): BSR20181210.

[2]. Wang, L., et al. (2013) Flagellar regeneration requires cytoplasmic microtubule depolymerization and kinesin-13. J. Cell Sci. 126, 1531–1540.

[3]. Kindle, K.L. (1990) High-frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1228–1232.

[4]. Nelson J.A. and Lefebvre P.A. (1995) Transformation of Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 513–51.

[5]. Yamano T., Iguchi H. and Fukuzawa H. (2013) Rapid transformation of Chlamydomonas reinhardtii without cell-wall removal. J. Biosci. Bioeng. 115, 691–694.

自从1938年BTX推出第一台商用电穿孔仪以来,BTX一直处于电穿孔技术的最前沿,一直致力于为各种细胞和组织类型提供完整的转染解决方案,包括真核生物,原核生物,体内组织,卵内,子宫内,贴壁和悬浮培养,植物细胞,皮肤和肌肉免疫。除电穿孔仪外,BTX还为各种应用提供和研发专业的电极。


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