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带你走出HPLC和UHPLC色谱柱的十大误区

色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成,是装填有固定相用以分离混合组分的柱管,多为金属或玻璃制作,有直管形、盘管形、U形管等形状。色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类,液相色谱通常均采用填充柱,色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相,以及色谱柱的制备和操作条件。

误区1 空气会彻底毁灭一根HPLC色谱柱

当色谱柱不与色谱仪连接的时候,用户需确保色谱柱被紧紧地密封。事实上,实际的应用中是,即使柱的端部进入了少量的空气也不要紧。因为当你将色谱柱连接到色谱仪上使用时,在系统初始加压阶段,在很短的时间内空气就会被溶剂冲刷掉。所以,不要因为色谱柱进入了空气而认定色谱柱已被损坏。

误区2 所有的C18(L1)色谱柱都是一样的

美国药典委员会(USP)开发了一种分类系统,用来对每种类型的键合相柱进行分类。由于C18色谱柱是一种广泛应用的色谱柱,故该系统将其称为“L1”。可惜不幸的是,大约有800种以上的L1流入了市场,因此,事实证明这个系统是不可靠的,是一个令人困惑的系统。

因为每种商品化的C18色谱柱,虽然同样是选用硅胶作为基体,但各自都有自己特定的填料键合合成工艺,因此色谱性能也不相同。

譬如,有的生产厂商采用十八烷基一氯硅烷键合试剂和低表面积的硅胶(见图一所示),而其它一些厂家采用同一硅烷试剂但选用了表面积更高的硅胶基体。

这两种C18柱表现的色谱性能不同,后者C18固定相的键合比例大于前者。较低的固定相键合比率,表面未反应的硅醇基较多,有时混合保留机理起主要作用。

某些色谱柱生产商使用二氯硅烷和三氯硅烷作键合试剂,将键合相聚合反应形成一很厚的具有不同扩散特性的疏水层。为使键合后硅胶表面未反应的硅醇基比例降低,有些生产商用小分子的硅烷试剂(如三甲基氯硅烷)封尾。

硅醇基是在中性条件下测定碱性物质时导致色谱峰拖尾的原因之一,有些生产厂家,更进一步的做法是采用第二种小分子硅烷进行双封尾工艺,以提供一个更加惰性(疏水性)的硅胶表面。

另外有些生产商采用聚合物基体材料进行C18 键合,生产出一种完全不同的C18填料,但仍然被归类到“L1”。还有厂家采用反应性能不同的硅烷化试剂organoalkoxysilanes,制造出一种与氯硅烷反应产生的不同的C18 固定相。

误区3 反相色谱柱不可以使用纯水相

这个误解其实是起源于有些用户在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时,发生了俗称相塌陷的现象,所以大家就认为反相色谱柱不可以使用纯水相。

许多色谱工作者都被相塌陷现象和保留时间位移现象困扰着,甚至已经失去了努力寻找解决途径的耐心。因此,他们索性就认为不应该在反相色谱柱中运行水含量很高的流动相。

然而,事实上市售的反相色谱柱(如极性嵌入和极性封端柱)都是具有水浸润性的,其表面特性是允许使用纯水的,而不会导致塌陷或者保留时间移位。

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